本文主要内容摘自：周亚利,江泉.藜麦蛋白肽QPP-Ⅰ对小鼠抗运动性疲劳作用的研究[J].食品科技,2024,49(07):196-204.
运动疲劳主要是由于长时间运动引起机体工作能力暂时下降，糖原能量储备量不足，导致代谢产物积累，机体内环境紊乱和产生氧化应激作用等现象[1-2]。随着对抗疲劳的逐步深入研究，许多有效的抗疲劳生物活性肽保健产品越来越受到关注，例如：甲鱼肽[3]、花生多肽[4]、鹰嘴豆多肽[5]以及大豆蛋白肽[6]等活性肽在抗疲劳方面具有广阔的应用前景。研究表明，蛋白质经酶解作用后可得到分子质量小、活性强、安全性高且更易吸收的抗氧化肽，不仅能够为机体提供能量，还可以通过清除机体内代谢产物和自由基等途径起到抗运动疲劳作用[7-8]。因此，将大分子蛋白分 解成小分子肽是近年来研究的重点。
藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)属于苋科藜属，是一种营养较为丰富的粮食作物，被联合国粮食及农业组织认定为最适宜于人类食用的“全营养食品”之一，有着“超级谷物”的美誉[9-10]。 藜麦富含膳食纤维、矿物质、维生素等多种营养 物质，脂肪酸多为不饱和脂肪酸，其中蛋白质含量为13%～22%，高于传统谷物[11-12]。此外，藜麦含有人体所需的全部必需氨基酸，是一种优质的蛋白质资源[13]，且具有降压、降脂及对心脑血管的保护作用，抗炎、抗菌及调节肠道微生物菌群等多种生物活性。藜麦作为一种全蛋白食品在食品工业和保健品领域中具有潜在的应用价值，然而，目前关于对藜麦蛋白肽的抗疲劳功能性研究报道较少。因此，本研究探讨藜麦蛋白肽的抗氧化活性和抗疲劳潜在作用，以期为藜麦蛋白进行保健食品深加工开发提供理论依据。
试验动物简介及分组
试验动物为6周龄 SPF级健康昆明种雄性小鼠，体质量(22±2)g，120 只，饲养温度为20～25 ℃、湿度为45%～65%，12 h 光/暗循环，以小鼠标准饲料常规饲养。首先将小鼠适应性饲养1周后开始正式试验。将小鼠随机分为5组(每组24只)，分别为空白对照组(灌胃同等体积的0.85%生理盐水)、阳性对照组(GSH)、低剂量组(200 mg/(kg·d))、中剂量组(400 mg/(kg·d))、高剂量组(800 mg/(kg·d))，灌胃量为0.01 mL/g bw，连续灌胃6周(见表1)，每天同一时间点灌胃一次、补充饲料和饮水，试验期间各组小鼠均自由饮水采食，观察其体征表现，每周称量各组小鼠的质量，观察小鼠体质量的变化，并记录整理测量结 果，连续灌胃给药42 d。
小鼠力竭游泳试验
末次灌胃1 h后，除空白组外，其他各组在小鼠尾部负重5%的铅丝，使其在恒温水槽中游泳(水温(30±2)℃，水槽深度40 cm)。记录小鼠从开始进入水中游泳至头部全部没 入水中10 s无法再浮出水面的时间，作为小鼠力竭游泳时间[5]。
小鼠爬杆时间测定试验
将小鼠放置在长 30 cm的玻璃棒上，玻璃棒的直径控制在10 mm左右，从而使小鼠身体各部位肌肉保持紧张感觉。 在整个试验过程中，注意记录小鼠攀爬玻璃棒的疲劳时间，详细记录爬杆时间[16]。
小鼠前肢抓力试验
末次给药30 min后，使用小鼠抓力测试仪，测试小鼠前肢抓力，每只小鼠重复试验3次[3]。
小鼠体质量及脏器指数
试验开始后，每周称量并记录小鼠的体质量。试验结束后，将小鼠解剖，取肝脏、肾脏、胸腺以及脾脏用生理盐水冲洗干净，滤纸吸取水分后，精确称取其质量[18]。
脏器指数计算公式如下：
脏器指数=脏器质量(g)/小鼠体质量(g)×100%
小鼠体内生化生理指标测定
在末次灌胃之后，小鼠休息30 min，然后在恒温水槽中游泳30 min后取出，15 min后眼眶取血，离心(3000 r/ min，15 min)，取上清液即为血清，–20 ℃冰箱中保存。采用相关试剂盒测量血液中尿素氮、乳酸、MDA、T-AOC、GSH-Px、CAT和SOD活性，然后将小鼠脱臼处死，取肝脏、肌肉组织，进行匀浆处理，按照试剂盒法测定检测小鼠肝糖原和肌糖原含量、肌肉CK和LDH含量[17]。
超滤各组分抗氧化活性的测定分析
以GSH为阳性对照，探讨QPP超滤各组分对 DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，结果如图1所示。
体外抗氧化活性结果表明：随着质量浓度的增加，QPP各组分对DPPH 自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力均逐渐增强。其中，超滤分离后QPP-Ⅰ组分对3 种自由基的清除能力明显高于QPP-Ⅱ、QPP-Ⅲ和 QPP-Ⅳ组的清除能力。当质量浓度为10 mg/mL 时，QPP-Ⅰ组的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力分别是 GSH的0.93、0.87、0.84倍。研究表明，多肽抗氧化活性与其分子质量具有相关性[18]。本研究表明，超滤分离得到的QPP-Ⅰ(分子质量＜3 ku)抗氧化活性显著高于分子质量较大的多肽，这与核桃蛋白肽[19]、红花籽[20]和紫苏籽[21]等植物蛋白肽的研究结果相一致。因此，选择QPP-Ⅰ(＜3 ku)组分用于后续小鼠抗疲劳试验。
QPP-Ⅰ氨基酸测定
结果分析如表2所示，QPP-Ⅰ中的氨基酸种类齐全， 共含有17种氨基酸。其中谷氨酸的含量最高，为 12.35%；其次为精氨酸和赖氨酸，分别为11.05% 和8.88%。QPP-Ⅰ中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的34.68%，与WHO/FAO倡议的必需氨基酸值相接近，当必需氨基酸的占比越高，说明藜麦蛋白肽的营养价值越高[22]。研究表明，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸和脯氨酸与多肽的抗氧化活性有关[17,23]。在运动过程中谷氨酸主要调控机体基本能量代谢；天冬氨酸参与机体的氨 代谢，将运动过程中机体产生的有害代谢废物排出体内，从而有效缓解运动疲劳；脯氨酸作为机体内自由基清除剂，具有良好的抗氧化活性。本研究结果表明，QPP-Ⅰ中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸和脯氨酸的含量相对较高，这表明 QPP-Ⅰ可能具有缓解运动疲劳的潜能。
小鼠抗运动疲劳的结果与分析
①QPP-Ⅰ对小鼠体质量和脏器指数的影响
由图2可知，随着灌胃时间的延长，小鼠体质量逐渐增加，各组小鼠体质量每周的增幅差异不显著 (P＞0.05)，且QPP-Ⅰ不同剂量组与Control组、GSH组均无显著差异(P＞0.05)。观察小鼠的行为特征，各组小鼠均精神良好，未出现异常和死亡。灌胃不同剂量的QPP-Ⅰ不会影响小鼠的正常生长，且QPP-Ⅰ对小鼠无毒副作用。脏器指数是反映小鼠机体健康状况的重要指标。由表3可知，不同剂量QPP-Ⅰ组小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、胸腺系数与Control组、GSH组相比均无统计学差异(P＞0.05)，表明灌胃QPP-Ⅰ对小鼠机体无毒副作用。
②QPP-Ⅰ对小鼠运动能力的结果分析
负重力竭游泳时间、爬杆试验和前肢抓力是评价运动耐力的重要指标。
如表4所示，与Control组相比，不同剂量QPP-Ⅰ组小鼠的负重游泳时间和爬杆时间均显著提高(P＜0.05)，且呈剂量依赖方式递增。与Control组相比，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ 和H-QPP-Ⅰ组小鼠游泳时间分别延长了4.77、 9.32 min和11.32 min；爬杆时间分别延长了 1.34、1.68倍和2.15倍，表明灌胃剂量与动物延长运动时间呈正相关。L-QPP-Ⅰ组小鼠前肢抓力与Control组比较无统计学意义(P＞0.05)，而 M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ组小鼠前肢抓力显著高于 Control组(P＜0.05)。上述结果表明QPP-Ⅰ具有提高小鼠运动耐力和抗疲劳的效果，能显著增强小鼠的运动能力。
③QPP-Ⅰ对小鼠糖原储备的影响
糖原含量是评价机体抗疲劳能力的重要指标[4]。机体内糖类物质主要以肝糖原和肌糖原的形式存在，糖原是运动期间重要的能量来源，当机体血糖不足，肌糖原通过无氧糖酵解途径直接给肌肉组织供能，而肝糖原转化为葡萄糖使机体维持血糖正常水平，并为机体供能。糖原储备量越多，说明机体运动耐受力越强[2,24]。
如图3所示，与Control组相显著提高了18.18%、57.10%、76.20%，肌糖原含量分别显著提高了42.67%、63.00%、92.00% (P＜0.05)，而GSH组肝糖原含量和H-QPP-Ⅰ组肝糖原含量相当，无显著性差异(P＞0.05)，这表明 灌胃QPP-Ⅰ可以改善小鼠的能量代谢体系，增加小鼠体内肝糖原和肌糖原含量的储备，从而提高机体的运动耐受力。此外，QPP-Ⅰ分子质量小，易被机体吸收，且必需氨基酸含量丰富，当运动过程中糖原供能不足时机体会分解蛋白质以提供能量，而QPP-Ⅰ此时能迅速为机体供能，延缓了由运动引发的供能不足而产生的疲劳，从而提高机体的抗疲劳能力。
④QPP-Ⅰ对小鼠抗疲劳运动代谢产物累积的影响
糖酵解是机体短时间内剧烈运动的主要能量来源。在进行剧烈运动时，肌肉耗氧量增加，机体葡萄糖转换成ATP的方式将以无氧代谢为主，糖酵解反应加速，造成乳酸的大量积累，使得肌肉组织和血液pH值降低，破坏酸碱平衡并影响新陈代谢，影响心脏循环和骨骼肌系统的功能，导致运动疲劳的发生[25-26]。长时间剧烈运动机体中的糖类、脂肪分解代谢无法满足其能量需求时，机体就会分解蛋白质供能。尿素是蛋白质代谢的最终产物，因此长时间剧烈运动会导致体内尿素氮含量明显升高。研究指出机体的尿素氮水平与运动耐受力呈负相关，机体对运动的耐受力越好，其运动过程中尿素氮含量就越低[27,6]。因 此，乳酸和尿素氮水平通常用于评价机体的疲劳程度。
如图4所示，与Control组相比，灌胃不同剂量QPP-Ⅰ组小鼠体内乳酸分别下降了14.23%、 22.63%和31.39%，M-QPP-Ⅰ组、H-QPP-Ⅰ组 与GSH组小鼠体内乳酸含量无显著性差异(P＞ 0.05)；与Control组相比，不同剂量QPP-Ⅰ组小鼠体内尿素氮含量分别显著下降了8.82%、14.57%和17.06%(P＜0.05)，其中，M-QPP-Ⅰ组、 H-QPP-Ⅰ组无显著性差异(P＞0.05)。上述结果表明QPP-Ⅰ能够清除运动过程中所产生的代谢废物的累积，从而缓解机体疲劳。
⑤QPP-Ⅰ对小鼠肌肉的保护作用
LDH和CK 是反映肌肉生理活性的关键代谢酶。LDH在机体运动时可将乳酸转化为丙酮酸，经三羧酸循环生成二氧化碳和水排出体外，从而减少乳酸在组织中的积累。严重的运动或肌肉损伤可能使LDH渗入血液，导致血液中LDH水平升高。LDH在缺氧条件下对清除血乳酸和供能具有重要作用[2,28]。剧烈运动后会造成机体的骨骼肌细胞受损，导致骨骼肌细胞中的CK外流从而引起血液中CK活性增加。因此，血清CK活性的变化常作为评价肌肉或骨骼肌损伤及恢复的重要指标，血清中CK活性越高表明骨骼肌损伤及疲劳越严重[17,29]。
如图5所示，与Control组相比，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ和 H-QPP-Ⅰ组小鼠运动后LDH含量分别显著降低了 14.53%、16.71%和21.71%，CK含量分别显著降低了15.67%、21.62%和26.50%(P＜0.05)。这表明 QPP-Ⅰ对减少LDH和CK积累具有积极作用，补充 QPP-Ⅰ能有效缓解小鼠剧烈运动后对细胞和肌肉造成的损伤，从而缓解运动性疲劳。相关研究表明，甲鱼肽[2]、榛仁小分子肽[17]也能够显著降低小鼠血清中CK和DHL活性，有效防止小鼠因运动产生的肌肉损伤，显著提高小鼠的抗运动疲劳作用，这均与本研究结果一致。
⑥QPP-Ⅰ对小鼠抗氧化能力的影响
自由基的过度产生是导致疲劳的主要原因，提高机体抗氧化能力有助于清除运动过程中产生的自由基，从而延缓疲劳感[29]。SOD、T-AOC、GSH-Px和 CAT是重要的抗氧化酶，可以抑制氧自由基的产生，维持机体氧化还原平衡[15]。SOD是机体内重要的抗氧化酶，在保护细胞膜的结构和功能的完整性方面至关重要[8]。CAT和GSH-Px可将机体中过量的H2O2催化分解，保护细胞膜结构和功能的完整性，提高抗氧化酶的活力有助于缓解疲劳[16]。T-AOC反映了酶和非酶系统对外部氧化应激的抵抗力以及体内自由基的代谢状态，主要功 能是维持环境中活性氧的平衡，清除过量的自由氧，使机体处于动态平衡状态[15]。剧烈运动会导致多不饱和脂肪酸的脂质过氧化，而MDA是细胞膜降解的脂质过氧化过程中的代谢产物之一， 因此MDA是反映生物体内氧化应激水平的重要指标。在运动过程中，MDA含量越高表明机体的疲劳程度越严重[5]。
由表5可知，与Control组 相比，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ组小 鼠体内SOD、T-AOC、GSH-Px和CAT活力均显著提高(P＜0.05)，其中，M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ 组与GSH组相比，SOD、T-AOC、GSH-Px和 CAT活力无显著性差异(P＞0.05)；小鼠灌胃 L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ组MDA含量 与Control组相比分别下降了10.55%、17.59%和 37.69%(P<0.05)，而H-QPP-Ⅰ组小鼠的MDA含 量与GSH组相比无显著性差异(P＞0.05)。上述结果表明QPP-Ⅰ能够提高小鼠体内抗氧化酶活性，抑制运动过程中小鼠细胞的脂质氧化，清除因运动产生的过量自由基，从而延缓小鼠运动疲劳。
⑦抗氧化活性与抗疲劳功效的相关性分析
由表6可知，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ和H-QPP-Ⅰ组中 SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT活力和MDA抗氧化水平与小鼠运动耐力相关生化指标之间具有显著相关性。QPP-Ⅰ可能是通过提高抗氧化酶活力，减少脂质过氧化物水平，提高骨骼肌能量代谢，保护机体细胞免受氧化应激损伤，从而起到抗运动性疲劳的功效。
